PCR Buffer-友名生物公司

污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：

（1）标本对照：被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。

（2）试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3、重复性试验。

4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。

PCR反应五要素

参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA部分片段，细胞内DNA复1制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2 )。

[PCR步骤]标准的PCR过程分为三步:

1.DNA变性(90°C-96*C): 双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火(25C-65"C): 系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性zui佳)的作用下，PCR Buffer，以dNTP为原料，从引物的5"端→3"端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的时间内copy完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60°C -65C间进行，以减少一次升降温过程，提

高了反应速度。

竞争性PCR(competitive PCR， c-PCR技术

c-PCR技术是竞争cDNA模板与目的cDNA同时扩增.使用同样的引物，但一经扩增后。能从这些目的cDNA区别开来。通常使用突变性竞争cDNA模板.其序列与目的cDNA序列相同.不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点突变性的cDNA模板可用适当的内切酶水解，并用分光计测定其浓度。cDNA目的序列和竞争模板相对应的含量.可用澳化乙锭染色.电泳胶直接扫描进行测定或掺入放1射性同位素标记的方法测定。竞争模板开始时的浓度是已知的.则cDNA目的序列的zui初浓度就能测定。这种方法能准确测定mRNA中cDNA靶序列.可用于几个到10个细胞中mRNA的定量。

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