pcr-英瀚斯-实时荧光定量pcr

15.测序发现引物有突变是怎么回事？

答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物， 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。核酸合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以**脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT，导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不造成的，Caping反应主要是封闭数5′-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能**脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚转化到大肠中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 （脱呤），2，6 diaminopurine ， DNA和扩增过程中DNA聚合酶将2，6 diaminopurine看作碱基A，实时荧光定量pcr，测序就会发现碱基G-A置换。脱呤现象在富含呤的引物中发生的频率较高。脱呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，荧光定量pcr，测序就会发现碱基G或A的缺失。

引物合成过程中，pcr，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。

注意事项

1. 为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。

2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。

3. 为了避免蛋白质的氧化，将 0.1～1 mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或 β-巯）加入到缓冲溶液中。

4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将 1～10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。

5. 为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均**时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。

6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。

7. 蛋白浓度不要太稀。

8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。

9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解，避免 DNA 对蛋白的污染。

RIP

技术概述

RIP是研究体内蛋白与RNA互作的重要技术。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-RNA”互作复合物，裂解细胞后，用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀，获得“靶蛋白-RNA”互作复合物，去交联分离其中的RNA;针对预测的靶蛋白结合RNA的序列设计引物，

做qPCR实验，验证预测的RNA是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的RNA做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的RNA。

技术流程

细胞交联-→细胞裂解-→免l疫共沉淀→去交联→RNA分离→建库→高通量测序(或qPCR)。

pcr-英瀚斯-实时荧光定量pcr由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司是从事“组织病理,细胞生物,分子生物学平台,动物模型医学科研外包服务”的企业，公司秉承“诚信经营，用心服务”的理念，为您提供较好的产品和服务。欢迎来电咨询！联系人：戴经理。

南京英瀚斯生物科技有限公司的团队实体组建于2013年，前期以“东较生物”运营医学科研外包业务，是南京国有资产监委会参股的，专注于医学科研外包服务的地区**企业。根据团队发展需要，医学科研外包业务自2020年以“英瀚斯”**独立运营。“英瀚斯”为Enhancer音译，寓意“英瀚斯”能像Enhancer在基因表达中起到增强作用一样，促进客户的科研进程，提高实验效率，让客户的科研idea*付诸实施，真正做到“思考留给科学，实验外包出去”！ 公司总部位于南京，在济南、西安、昆明、福州、合肥、乌鲁木齐、银川等地设有办事处，并于2015年在东南大学地区大学科技园内建设有完善的实验研发平台，包括标准动物实验室、细胞学实验室、分子生物学实验室和病理学检测实验室；公司已经通过了ISO9001质量管理体系认证，拥有技术平台，包括：动物实验平台、分子生物学平台、细胞生物学平台、组织病理学平台以及电生理检测等平台，可以为制药公司、医院、科研单位等科研工作者提供整体科研解决方案和医学科研服务。 公司目前拥有多项专li产品及技术，其中发明专li两项，软件著作权八项，实用新型专里三项，商标两件。公司先后获得“江苏省民营科技企业”、“江苏省科技型中小企业”、“江苏省专精特新中小企业”等荣誉资质，连续多年被评为“东南大学地区大学科技园企业”。2019年公司成为江苏省生物技术协会*七届理事会的特邀理事，成立了“李冬冬**工作室”，并获得了南京市“工人成员号”的荣誉称号。 英瀚斯（东较）生物始终以“信誉**，合作共赢”为发展原则提供高质量的医学科研外包服务，我们已经与来自各地几百家医院、企业及科研院所建立了长期的合作关系。南京英瀚斯，医学科研的增强子！合作只是起点，服务没有终点！我们致力于做**的医学科研外包服务商。