PCR实验室-pcr-英瀚斯

DNA测序检测

1. PCR测序反应

(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

BigDye Mix

1μl

1μl

待测的质粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf ( )双链DNA

-1μ1

待测DNA的正向引物

1μ 1

M13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

2μ 1

总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，pcr，用手指弹管混匀，PCR实验室，稍离心。

(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，

PCR循环参数为96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 个循环，扩增结束后设置4C保温。

2.乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C离心30 min，小心弃上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min，小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1)加入12μ 1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。

(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min)，冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

线粒体测序

线粒体是真核生物的重要细胞器，是生物体的能量工厂，参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动，对生物的生理活动起着至关重要的作用。大部分线粒体基因由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点，被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、疾病诊断等学科领域。线粒体全基因组在生物进化的研究中具有的优势。由于线粒体有着与真核生物长期共生的进化历史，因此其基因组包含了反映物种进化的关键信息，同时，pcr引物设计，相对于核基因组，线粒体基因组小，*对大量物种进行横向的比较分析，有利于生物进化的研究，因而受到进化生物学家的钟爱。线粒体的组成可以从两个层面上反映物种及群体的遗传和进化，即核酸序列组成和基因组的结构特征，两者的特征具有不同的进化机制和进化速度，在进化生物学研究中可以很好的互补。

13.合成的引物5"端是否有磷酸化

答：合成的引物5"为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，pcr检测，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。

14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。

PCR实验室-pcr-英瀚斯由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司在技术合作这一领域倾注了诸多的热忱和热情，英瀚斯一直以客户为中心、为客户创造**的理念、以品质、服务来赢得市场，衷心希望能与社会各界合作，共创成功，共创辉煌。相关业务欢迎垂询，联系人：戴经理。

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